植物直接PCR试剂盒

产品货号：

SY0823

中文名称：

植物直接PCR试剂盒

英文名称：

Plant Tissue PCR Kit

产品规格：

50T|200T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强。试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至1mm植物叶片即可进行实验。本试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。

本试剂盒中提供的2×Plant Master Mix包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等，同时包含电泳Loading Buffer,PCR完成之后可直接电泳。2×Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。

组分		50T	200T	保存
包装一	Buffer P1	1.25mL×2	5mL×2	4℃
包装一	Buffer P2	500μL	1mL×2	4℃
包装二	2×Plant Master Mix	500μL	1mL×2	-20℃

保存：包装一置于4℃，包装二置于-20℃，避免反复冻融，有效期1年。

注意事项

做叶片实验时，建议使用新鲜采取的叶片组织，若为长期冷冻组织，需-80℃保存，应尽量避免反复冻融，以免造成模板降解，影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜，若为成熟的叶片，避免使用叶片主脉部位组织。
建议扩增片段长度1kb以内，以便扩增效率最佳。
取样时使用打孔器或者刀取适宜大小的样本，样本不同时，打孔器或者刀每次处理样本前需清洗干净。
对于叶片组织，建议取1～10mm的叶片，过小会使PCR扩增产量低，过多会抑制PCR反应，采用加热裂解法、枪头捣
碎、研磨仪破碎的方式处理植物叶片，处理后需震荡离心，务必取上清液试验，沉淀会严重抑制PCR反应。
为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
本制品仅作科研用途！

植物叶片样本前处理
- 研磨裂解法：
  - 研磨仪破碎：将直径5mm左右的叶片置于50μL Buffer P1中，用研磨仪加钢珠（钢珠直径3mm左右，共2个）破碎叶片（45 Hz，1min），叶片破碎后溶液呈现绿色，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1μL用于PCR扩增。
  - 枪头捣碎：推荐使用幼嫩叶片。将直径5mm左右的叶片置于50μL Buffer P1中，用枪头将叶片捣碎，捣碎后溶液呈现绿色，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1μL用于PCR扩增。
- 加热裂解法：推荐使用幼嫩叶片。将直径5mm左右的叶片置于50μL Buffer P1中，95℃加热5～10min（确保裂解液完全浸没叶片），较难裂解的叶片（老叶片）可适当延长时间（10～20min），加热裂解后溶液呈现绿色，震荡混匀，瞬时离心，上清液请放在4℃备用，取1μL用于PCR扩增。
- 直接法：推荐使用幼嫩叶片。使用打孔器或者刀，将直径1mm左右的叶片直接加入到PCR反应体系中；复杂样本或者是长片段的扩增，推荐使用直径<1mm的叶片。

PCR反应体系

成分	20μL体系	50μL体系	终浓度
2×Plant Master Mix	10μL	25μL	1×
Forward Primer (10μM)	0.5μL	1μL	0.2～0.25μM
Reverse Primer (10μM)	0.5μL	1μL	0.2～0.25μM
裂解产物（DNA模板）	1μL	2μL	-
ddH₂O	至20μL	至50μL	-

注：各组分使用前应充分混匀。

模板加入量：小于PCR反应体系的5%，过多会严重抑制PCR反应，强烈推荐加入1μL模板。叶片直扩优先推荐研磨仪裂解法。
引物终浓度：0.2～0.25μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1～0.5μM范围内调整引物浓度。
反应体系：推荐使用20μL或50μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。
对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
为了更稳定的保存裂解后的模板，将转移出来的上清液，按照裂解产物（DNA模板）：Buffer P2 = 5:1的比例混合，混匀后-20℃保存，稳定保存随时间和样本状态不同而有所不同。如果处理后的植物叶片上清液一周内用于PCR扩增，不用加Buffer P2，上清液请保存在-20℃。

PCR反应条件
步骤温度时间循环数
预变性 94℃ 5min 1
变性 94℃ 10sec 35
退火 50～65℃ 20sec
延伸 72℃ 1min
终延伸 72℃ 5min 1
注：
- 退火温度：请参考引物的理论Tm值，退火温度可设置低于引物理论值2～5℃。
- 延伸时间：需要根据片段的长度来确定，对于1kb以内的DNA片段，建议延长时间为1min。

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2×PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	裂解液、中和液加入比例不当，裂解混合液影响PCR体系的pH值。	正常条件下，中和后的裂解混合液的pH应该在7～8左右(裂解产物和Buffer P2严格按照5:1的量进行中和)。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存5天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系＜5%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐35-40循环为佳。因模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5～10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
阴性对照出现目的条带	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5min	1
变性	94℃	10sec	35
退火	50～65℃	20sec
延伸	72℃	1min
终延伸	72℃	5min	1

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